RNA pull-down
▼ 服務介紹
RNA分子能夠與其他生物分子，如蛋白質、DNA和RNA，發生廣泛的相互作用，從而以大分子復合物的形式存在于細胞及生物體中，其中，RNA-蛋白質復合物是RNA存在以及發揮功能的重要形式之一。RNA pull-down是檢測與RNA（如 miRNA、lncRNA）相互作用的未知蛋白的重要技術之一。
【技術原理】
首先標記 RNA（如生物素探針標記 RNA），將其與細胞裂解液共同孵育，形成 RNA-蛋白質復合物，分離復合物得到蛋白質，通過蛋白免疫印跡（western blot）或質譜（massspectrometry）檢測蛋白。
【實驗方法】
Step1：生物素探針標記RNA的制備
Step2：RNA抽提
Step3：細胞裂解
Step4：磁珠預處理
Step5：RNA與磁珠結合
Step6：RNA 與蛋白相互作用
Step7：蛋白的檢測
【實驗流程】
【常見問題】
1、RNA結合蛋白沒有結合
可能原因：（1）靶蛋白量不足；（2）緩沖體系不對；（3）RNA探針和蛋白的親和力本來就低。
解決方法：（1）增加上樣蛋白量；（2）應用低鹽體系；（3）加入交聯試劑。
2、RNA 降解
可能原因：無核酸酶的環境被破壞，比如RNA提取過程中的試劑及材料等；體外轉錄的RNA探針降解等。
解決方法：清洗和使用新開的離心管和試劑等；RNA探針合成后，電泳檢測其長度和濃度。
3、RNA結合蛋白的親和力不夠
可能原因：結合緩沖環境沒有優化、裂解不完全、磁珠用量不足、RNA探針用量不足等。
解決方法：優化孵育時間、溫度、鹽濃度等條件、增加裂解液和蛋白上樣量的比例、適當改變磁珠及探針用量、增加裂解液、確定生物素和鏈霉親和素效率等。
4、結合的非特異性高
可能原因：（1）緩沖環境沒有優化；（2）緩沖環境嚴謹性低；（3）樣品沒有裂解完全和裂解體系沒有優化。
解決方法：（1）優化孵育時間溫度鹽濃度等條件；（2）使用嚴謹性高的緩沖體系；（3）調低RNA探針和樣品的比例；（4）提高裂解液的量。
5. WB信噪比高
可能原因：（1）陽性信號率低；（2）一抗效率低；（3）蛋白沒有充分溶解。
解決方法：（1）增加二抗的量；（2）用敏感度的化學發光液；（3）用細胞裂解液預孵一抗；（4）增加樣品的量；（5）確定有沒有其他可能的結合情況；（6）增加裂解液用量。
【注意事項】
1、RIP反應體系中的試劑和抗體中均需保證無RNase；
2、磁珠與帶標簽的RNA要充分混合，可優化孵育的溫度、時間以及RNA的含量等。
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